DMSO冷凍細胞原理

在盧威廉實驗之後的數十年間，培養細胞的唯一方法是將細胞保持於恆溫的培養器中，並將溫度固定在人類的體溫攝氏三十七度。然而取自發育完全的人類或動物的細胞，在歷經數回合複製後，就會神祕地死亡，似乎失去了繼續分裂的能力。
　
　　　但癌細胞卻具有持續生存、分裂的不朽本領，這種造成癌症病患死亡的特性，卻是細胞生物學家的無價之寶（因為這使他們可繼續培養細胞）。
　
　■細胞抗凍劑原理
　
　　　直到一九四九時，才由英國生物學家帕克斯（Alan Parkes）發展出一套全新保持細胞的方法─—冷凍細胞。許多研究者已為此嘗試有數十年之久，特別是如何保存得獎公牛的精子，這樣即使在公牛死後，仍能利用人工受精的方法維持優良品種。研究者發現，冷凍過程會殺死細胞，即使有少數細胞在解凍後還存活著，但卻已奄奄一息；直到帕克斯發現在營養液中加入一些抗凍劑，並以非常緩慢的方式冷卻細胞，就可使細胞進入休止期，且在回溫後仍能恢復活力。使帕克斯成功的，是也被用於汽車抗凍劑的無色糖漿狀液體─—甘油。現今更好的替代品是DMSO，這是一種無色液體，為製造紙漿的副產品，可用來除去油漆，或作為抗炎藥品。
　
　　　但無論是甘油或DMSO，抗凍劑對細胞仍是有毒的，所以一旦在培養液中加入抗凍劑後，就必須儘速冰凍起來以免細胞受損。這些細胞就在含有百分之五抗凍劑的營養液中，分裝到各小瓶內；在ATCC，這些細胞瓶會先安置在特別的冷凍庫中，在一小時之內由室溫逐漸冷卻至攝氏零下80度，因為太過急速的冷凍會殺死細胞；在許多實驗室中，細胞瓶則先放在保麗龍盒中，再存入冰凍庫，由於保麗龍可延緩溫度流失，使細胞在適當的速度下降溫。
　
　　　在這過程中，細胞內發生了什麼變化呢？由於存在細胞中的分子會降低水的凝固點，在緩慢降溫的情況下，細胞外的水將較細胞內的水早凝固，而抗凍劑可使細胞外形成的水結晶不致於過大而刺破細胞膜；然而，當細胞外的水逐漸結晶時，細胞內的液體也會透過細胞膜而滲透流失，細胞因失水而萎縮成扁平狀，如果條件正確，細胞內的水在冷到足以形成大結晶而刺破細胞內膜之前，都已離開了細胞。
　
　　　隨著小瓶溫度的下降，所有構成生命現象的代謝作用也將變得愈來愈緩慢。當溫度低到一定程度時，這數百個生化反應，都將全部停止。這時細胞的情形就好比一隻進入冬眠期的超級小熊（不過
　
　熊在冬眠時仍有緩慢的代謝反應進行）。這些殘存的結構形式，在溫暖的狀態下毫無疑問是活的；但如今在冰凍的情況下，細胞逐漸喪失一般教科書定義生命的條件。
　


在諸多的冷凍劑中，如液態空氣、氫、氦及氮中，以液態氮被認為是最安全及最符經濟效益的 (Jong, 1987)，然在超低溫凍化過程中，由於水分的傳送均經過細胞膜，冷凍時細胞內冰晶的形成刺傷胞膜與胞內溶質濃度增高，容易導致凍害。控制適度降溫速率可提高細胞存活率，為能降低在凍結及解凍時所發生的冰晶傷害程度，採用適當的化學保護劑，可以減少冰晶的形成。目前已有很多的化學化合物曾被單獨或混合使用為冷凍保存菌種的抗凍劑，這些抗凍劑能控制冰晶的大小及形成速率，能緩和溶質的濃度的急速增高及增加細胞膜的水滲透性，並降低細胞內容物的凝結點，以利冷凍時細胞脫水的進行。抗凍劑有兩大類型，一為浸入型，如甘油及DMSO等，此等溶液能滲入細胞內，而得以胞內及胞外同時發揮其保護效果；二為非浸入型，如糖類及PVP等，用於使胞內胞內於冷凍時與水分子產生結構上的改變與細胞內溶質濃度的平衡，避免脫水過度。
控制冷凍之降溫速率能使細胞外溶液凍結而細胞內不凍結（Pegg, 1976），由於擴散的原理而導致細胞逐漸脫水至細胞外結冰，以防止冰晶對細胞造成膜的破裂，形態的改變、抑制 RNA, DNA 的合成等等傷害（Calcott, 1985）。細胞質的冰點 (freezing point) 常大於-1℃ ，而且有超冷的現象(supercooled)，即使細胞外的液體已結冰，而細胞內尚末凍結，此現象顯示細胞膜可防止外部冰晶進入超冷的內部，亦即細胞內不含有超冷的冰核 (Mazur, 1970)。然降溫速度若過於緩慢，則會因嚴重失水造成胞內毒害，但降溫速度若太快易使得細胞內結冰而刺傷細胞（Pegg, 1976; Pegg & Shell, 1984），而直接置入 -80 ℃及液態氮中保存，由於降溫速度太快阻礙保存之效果（Jong, 1987）。快速解凍可以減少解凍過程中冰晶的再形成對菌體造成傷害，故以37 -45℃快速解凍可以減少解凍過程冰晶之再形成，提高存活率（Goos, 1967）。

（三）、組織細胞的保存：   為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，最佳的策略是進行低溫保存。這對於維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(－70℃—－196C)的特點。   細胞深低溫保存的基本原理是：在－79C以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處於完全停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在於通過0C-20C階段的處理過程。在此溫度範圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。用電鏡觀察，可見細胞的核膜上有大量針尖樣小孔。牛化研究發現，在此溫度範圍內，鉀離子和鈉離子集聚在細胞兩側，具有細胞毒性。因此，為了避免0C—— 20C冰晶的形成和細胞膜兩側離子平衡的破壞，需要加保護劑。目前常用的保護劑有甘油和二甲基亞礬(DM50)，它們可降低冰點，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外。貯存在-130C以下低溫中能減少冰晶形成，DMSO和甘油對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，使用濃度範圍為5％—15％，一般常用10％o   為了保持細胞最高的存活率，一般採用慢凍快融的策略。標準冷凍速度以13℃／分的速度下降，當溫度達— 30C時，下降速率可增至15C— 30C／分，到達-100C時則可迅速浸入—1％℃的液氮中。要適當掌握下降速度，過快將減少細胞水分透出，太慢則易促進冰晶形成。   復蘇細胞時，可將細胞取出後立即投入37C-40C水溶化凍融，迅速通過細胞最易受損的-50℃。此時細胞仍能生長，活力不受任何影響。

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